Des séries de travaux s'étalant de 1928 à 1952 vont permettre d'associer définitivement l'ADN à la notion d'information génétique. Ces travaux sont exposés ci dessous car ils présentent, comme ceux de Mendel, beaucoup plus qu'un intérêt historique : ils sont des modèles d'analyse faisant appel, pour la première fois, à des méthodes de la biologie moléculaire.

Que disent les travaux de Griffith ?

Le point de départ est une bactérie pathogène, un pneumocoque, agent de la pneumonie chez l'homme (et, au laboratoire, létal pour la souris). Cet exemple rappelle que ce sont les pathologistes qui ont amené les généticiens à étudier les procaryotes et les virus.

La virulence de bactéries représente déjà un caractère phénotypique, un autre est apporté par l'aspect des colonies qui se développent à la surface d'un milieu nutritif gélosé lorsque l'on a ensemencé une boite de Pétri : un mucopolysaccharide secrété par les bactéries donne un aspect huileux aux colonies, ce phénotype est baptisé « S » (comme smouth = lisse).

Lors de repiquages et d'étalement successifs, on voit parfois apparaître des colonies présentant un phénotype différent : « rugeux » par opposition à lisse d ésigné par « R" » (comme rough).

Inoculées à une souris, les bactéries de type R s'avèrent non virulentes. Les deux phénotypes sont liés.

Remarque : L'apparition, rare et spontanée, de variants dans une population bactérienne est le résultat d'une mutation. A l'origine, une seule bactérie est modifiée mais cette modification étant héréditaire, la colonie que l'on observe représente en fait la descendance de la bactérie mutée.

Remarque : Selon des mécanismes qui seront détaillés plus tard, l'accident mutationnel peut, dans certains cas, se produire « dans l'autre sens » : dans une population R peut spontanément réapparaître un individu S, cette modification est, elle aussi héréditaire puisque ce que l'on observe c'est une colonie S c'est à dire une descendance.

Une des caractéristiques de ce phénomène de réversion est qu'il se produit avec la même fréquence que la mutation : c'est un événement très rare. Cette notion de réversion, simplement effleurée ici, s'avérera très importante.

Une expérience fondamentale

Vers 1928, Griffith réalise une expérience fondamentale :

• première étape : il inocule à une souris, des bactéries S (de phénotype virulent) tuées par la chaleur, les souris ne présentent aucun trouble.
• deuxième étape : il inocule des bactéries S tuées par la chaleur après les avoir mélangées à des bactéries R (phénotype non virulent), des souris meurent de pneumonie. Le prélèvement de bactéries à partir de souris mortes et leur mise en culture révèle un phénotype S (et virulent) pour toute la descendance.

Interprétation : les bactéries vivantes au départ sont de type R, non virulent. Griffith, suppose qu'elles ont été « transformées » par un élément provenant des bactéries tuées par la chaleur. La fréquence de la transformation et des arguments d'ordre immunologique excluent un phénomène de réversion.
A l'époque, Griffith ne peut que conclure à l'existence d'un facteur transformant or il s'agit bien d'une transformation génétique au sens actuel du terme.
En 1944, Avery, Mc Leod, Mc Carthy reprennent ces travaux avec des tests un peu plus sophistiqués qui préfigurent la génétique microbienne moderne : ils mélangent, dans un tube, des bactéries S tuées par la chaleur et des bactéries R. Après un temps de culture suffisamment long, un anticorps anti R est ajouté, (plusieurs souches de ces actéries ont été répertoriées, qui diffèrent par leurs propriétés antigéniques), les bactéries R sont agglutinées et sédimentent au fond du tube, le surnageant est ensuite étalé sur un milieu nutritif et l'on s'aperçoit que des colonies de phénotype S se développent. Cette manipulation in vitro va servir à l'identification du principe transformant en ajoutant à des bactéries R, non plus des S tuées par la chaleur mais des extraits relativement purifiés de celles-ci. Les auteurs de ce travail se tournent d'abord vers les polysaccharides de la paroi, sans aucun résultat puis vers les protéines sans plus de succès, ils n'obtiennent quelques cas de transformation qu'avec des préparations d'acides nucléiques et particulièrement d'ADN.
Autrement dit, une bactérie peut acquérir de nouveaux caractères phénotypiques, de nouvelles fonctions métaboliques (sécrétion de polysaccharides, virulence) par l'intermédiaire d'ADN provenant d'une autre.

L'importance de ces travaux

L'importance extraordinaire de ces travaux n'a pas été reconnue pendant longtemps pour plusieurs raisons :

- la structure chimique de l'ADN bien que déterminée d'une façon très incomplète, semblait trop simple pour pouvoir contenir une information aussi complexe que l'information génétique. Les protéines en faisait de bien meilleures candidates comme support de cette information.
- la génétique microbienne était à ses début et l'on n'était pas certain que le passage d'un type S à un type R soit le fait de mutations, ni que l'hérédité des organismes supérieurs soit comparable à celle des bactéries.

C'est Oswald Avery (1877-1955) et ses collègues Colin McLeod et McLyn McCarthy, qui réussisent à purifier le facteur transformant du pneumocoque après d'innombrables tentatives infructueuses de nombreux chercheurs pendant 10 ans. Leur publication date de 1944.

Expérience d'Avery, McLeod et McCarthy, 1944

Ils réalisent un extrait chimique assez bien purifié de SIII (voir expérience de Griffith) contenant essentiellement des acides nucléiques (ARN et ADN) et un peu de protéines. Ils ajoutent une petite quantité de RII vivantes à une grande quantité d'extrait de SIII. Ils obtiennent des SIII vivantes. S'ils ajoutent à l'extrait de la trypsine ou de la chymotrypsine (enzymes coupant de nombreuses protéines) le résultat est le même . S'ils ajoutent une ribonucléase à l'extrait le résultat est identique. Par contre la transformation n'a pas lieu s'ils ajoutent de la désoxyribonucléase. C'est donc bien l'ADN qui est le principe transformant.

En analysant ces deux expériences dans une perspective moderne, on a donc la preuve que l'ADN est une molécule transmissible et suceptible d'être utilisée par une cellule procaryote pour modifier une de ses caractéristiques structurales : ici la synthèse d'une capsule.

A partir de 1937, Max Delbrück (1906-1981) travaille sur le bactériophage et fonde ce qui va devenir la « Groupe du phage » avec l'arrivée en 1941 de Salvador Luria puis de Alfred Hershey en 1943. Une publication marquante de ces années est l'expérience complémentaire de Alfred Hershey et Martha Chase de 1952 qui confirme le rôle de l'ADN comme porteur de l'information génétique du phage T2.
Expérience de Hershey et Chase, 1952

Le 32P est utilisé comme traceur pour l'ADN et le 35S pour les protéines. L'expérience utilise des bactériophages T2 qui se reproduisent dans une bactérie: Escherichia coli. Deux lots de virions sont incubés en présence d'E. coli: le lot 1 possède de l'ADN marqué au 32P et le lot 2 des protéines de la capside marquées au 35S. Chaque culture est ensuite mixée et centrifugée. Pour le lot 1, c'est le culot qui est radioactif (30 % de la radioactivité initiale), alors que c'est le surnageant du lot 2 qui est radioactif.

Les culots sont mis en culture et produisent des virus. On observe une radioactivité de 30 % de la radioactivité initiale dans le lot 1.

Lors de l'infection virale étudiée, c'est donc bien l'ADN du phage T2 (et non les protéines de la capsule) qui contient l'information génétique et est transféré à la cellule hôte. Cet ADN contient l'information nécessaire à la synthèse de nouveaux virions par la cellule hôte.
Toujours dans la même optique cette expérience prouve que l'ADN contenu dans les irus et injecté dans les cellules hôtes bactériennes peut être utilisé par celles-ci pour produire de nouvelles particules virales.

Cette expérience semble avoir eu un retentissement très grand notamment du fait qu'elle fut publiée à peu près en même temps que le modèle de la structure de la molécule d'ADN en 1953 par James Dewey Watson (1928-) et Francis Harry Compton Crick (1916-). Le modèle en double hélice a été élaboré à partir de la composition chimique de l'ADN, notamment grâce aux travaux de Erwin Chargraff (1905-) (qui avait montré que, pour toute molécule d'ADN, le nombre de molécules d'adénine est égal au nombre de molécules de thymine (A=T) et que celui de cytosine est égal à celui de guanine (C=G)), des clichés de diffraction X d'ADN cristallisé obtenus par Maurice Wilkins et de Rosalind Franklin décédée prématuremment (1920-1958) (clichés publiés en 1953 dans le même numéro de nature que celui présentant le modèle de Watson et Crick et différenciant deux formes de la molécule: forme A et B (hydratée)), et des clichés de microscopie électronique qui montraient une molécule de 2 nm de diamètre. Watson et Crick proposent déjà dans leur article de 1953 un modèle d'appariement des bases pour la réplication de la molécule.

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Olivier

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