La constitution des bactéries

En  plus  de  leur  chromosome  de  4  millions  de  paires  de  bases,  les bactéries  possèdent  généralement  de  petites  molécules  d'ADN  circulaire dont  la  taille  varie  entre  1  kb  et  200  kb.  Ces  minichromosomes  ou plasmides  se  répliquent  et  se  transmettent  indépendamment  du  chromosome bactérien,  mais  ils  dépendent  des  protéines  et  enzymes  de  leur  hôte  pour leur  réplication  et  la  transcription  de  leurs  gènes.  Fréquemment,  ils  portent des  gènes  codant  des  enzymes  qui  dans  certaines  circonstances  rencontrées dans  la  nature  confèrent  un  avantage  à  l'hôte  bactérien.
 Parmi  ces  propriétés  avantageuses,  il y a  la  résistance  à  des antibiotiques, la production d'antibiotiques, la dégradation de composés organiques  complexes  ainsi  que  la  production  de  colicines,  d'entérotoxines et  d'enzymes  de  restriction  et  modification.  Que  ces  gènes  aient  été trouvés  sur  des  plasmides  plutôt   que  sur  le  chromosome  bactérien  n'est pas  dû  au  hasard.  Comme  ces  gènes  sont  localisés  sur  des  plasmides présents  dans  la  cellule  en  plusieurs  copies,  leur  nombre  est  beaucoup  plus  important  que  s'ils  étaient  localisés  sur  le  chromosome.  Comme l'ADN  plasmidique  est  de  beaucoup  plus  petite  taille  que  n'importe  quel ADN  chromosomique  même  très  fragmenté,  il  est  facilement  séparable  du reste  du  matériel  génétique..
La  structure  du  plasmide : On  peut  obtenir  de  grandes  quantités  de  plasmide  très  pur.  L'ADN plasmidique  extrait  d'une  bactérie  se  trouve  principalement  sous  une  forme surenroulée.  L'ADN  surenroulé  adopte  une  configuration  plus  compacte  que  l'ADN  sous  forme  relâchée  et  il  migre  donc  plus  vite  que  ce  dernier lors  d'électrophorèse  en  gel  d'agarose.

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C'est parti

La transformation des bactéries

La  tranformation  des  bactéries : D'une  façon  générale,  une  cellule  bactérienne  donnée  ne contient  qu'un  seul  type  de  plasmide.  Au  laboratoire,  il  existe  plusieurs  méthodes  pour  introduire  un  plasmide  dans  une  bactérie.  On  ajoute  l'ADN  plasmidique  à  des  bactéries  traitées  au  CaCl2  et  on  soumet  l'ensemble  à  un   bref   choc   thermique.   Ce   procédé   est   appelé  transformation.
Ce  procédé  soumet  les  bactéries  en  suspension  dans  de  l'eau  à  une différence  de  potentiel  élevée  pour  ouvrir  temporairement  des  pores  dans  la  paroi  des  cellules.  L'efficacité  de  transformation  est  inversement  proportionnelle  à  la  taille  du  plasmide.  C'est  la  raison  pour  laquelle  on préfère  transformer  des  plasmides  de  petite  taille.
Dans  les  meilleures  conditions,  les  plasmides  ne  se  maintiennent  que dans  une  minorité  de  la  population  bactérienne.  Pour  identifier  les  bactéries  transformées,  on  utilise  des  marqueurs  de  sélection  portés  par  le plasmide.  Les  marqueurs  de  sélection  les  plus  utilisés  sont  les  gènes  de résistance à des antibiotiques, comme l'ampicilline, la tétracycline, le chloramphénicol  et  la  kanamycine.  Par  la  suite,  les  bactéries  transformées sont  cultivées  en  présence  de  l'antibiotique  de  manière  à  éviter  que  la bactérie  ne  perde  le  plasmide  qu'on y a  introduit.
Le  réplicon : L'élément  génétique  qui  contrôle  le  nombre  de  copies du  plasmide  se  trouve  dans  une  région  de  l'ADN  plasmidique  qui  inclut l'origine  de  réplication.  L'origine  de  réplication  et  les  éléments  de  contrôle associés  définissent  une  unité  génétique  appelée  « réplicon ».
Des   plasmides  à  contrôle  de  réplication  relâché  se  multiplient  dans les  cellules  jusqu'à  ce  que  chaque  cellule  ait  en  moyenne  10  à  200  copies du  plasmide.  Au  contraire,  des  plasmides  à  contrôle  de  réplication  strict (« stringent »)  se  répliquent  en  même  temps  que  le  chromosome  bactérien et  ne  sont  donc  présents  qu'à  raison  d'une  ou  de  quelques  copies  par cellule.
Le  principe  du  clonage: Le  principe  du  clonage  est  simple.  Il consiste  à  insérer  un  segment  d'ADN  étranger  dans  une  petite  molécule capable  de  se  répliquer  de  façon  autonome.  Ce  type  de  molécule  d'ADN est  appelé  un  vecteur  d e clonage.
Un  vecteur  de  clonage  courant  est  le  plasmide  bactérien.  L'ADN  du plasmide  est  coupé  par  une  enzyme  de  restriction  et  lié  in  vitro  au fragment  d'ADN  étranger  coupé  par  la  même  enzyme  de  restriction  ou  une  enzyme  qui  donne  des  extrémités  compatibles.

Les  molécules  d'ADN  résultantes  sont  transformées  dans  des bactéries.
Il  est  crucial  de  pouvoir  distinguer  entre  les  colonies  qui  contiennent des  plasmides  recombinants  et  celles  qui  contiennent  les  non  recombinants, c'est-à-dire  entre  plasmides  qui  contiennent  l'ADN  étranger  et  plasmides qui  se  sont  refermés  sans  prendre  cet  ADN  étranger.  Lorsqu'un transformant  stable  a  été  obtenu,  la  séquence  est  dite  clonée.
Pour  être  de  bons  vecteurs  de  clonage :
- les  plasmides  doivent être  petits  et  se  répliquer  sous  contrôle  relâché.  La  plupart  des  plasmides utilisés  actuellement  portent  un  réplicon  dérivé  du  plasmide  pMB1,  qui  a  été  isolé  d'un  échantillon  clinique.  Dans  des  conditions  normales  de culture,  on  trouve  un  minimum  de  15  à  20  copies  du  plasmide  portant  ce réplicon  dans  chaque  cellule  bactérienne.
- ils  doivent  porter  des  marqueurs  génétiques  particuliers,  comme  des gènes  de  résistance  aux  antibiotiques  ou  le  gène  codant  la  ß-galactosidase.
- ils  doivent  porter  un  ou  plusieurs  sites  de  restriction  uniques  dans une région qui n'est pas essentielle pour la réplication des plasmides.
- et  si  possible,  ils  doivent  avoir  des  sites  de  restriction  uniques  dans des gènes codant des marqueurs sélectifs. Ces marqueurs sont inactivés lorsqu'on y  insère  un  fragment  d'ADN  étranger.

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Olivier

Professeur en lycée et classe prépa, je vous livre ici quelques conseils utiles à travers mes cours !